Una variante común de aldehído deshidrogenasa 2*2 de Asia oriental promueve la arritmia ventricular con luz crónica

Jun 21, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 610 (2023) Citar este artículo

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El consumo excesivo de alcohol crónico se asocia con arritmias letales. Aún no está claro si la deficiencia común de aldehído deshidrogenasa específica de Asia oriental (ALDH2*2) contribuye a la arritmogénesis causada por el bajo consumo de alcohol. Aquí mostramos que 59 consumidores habituales de alcohol que portan ALDH2 rs671 tienen un intervalo QT más largo (corregido) y eventos de taquiarritmia ventricular más altos en comparación con 137 consumidores habituales de alcohol ALDH2 de tipo salvaje (Wt) y 57 no consumidores de alcohol. En particular, observamos una prolongación del intervalo QT y un mayor riesgo de contracciones ventriculares prematuras entre las variantes humanas de ALDH2 que muestran un consumo habitual de alcohol de ligero a moderado. Recapitulamos un fenotipo de prolongación del intervalo QT electrofisiológico humano utilizando un modelo de activación (KI) de ALDH2*2 de ratón tratado con etanol al 4 %, que muestra una cantidad total notablemente reducida de conexina43 aunque una lateralización aumentada acompañada de una regulación negativa marcada de Nav1.5, Kv1.4 del sarcolema. y expresiones de Kv4.2 en comparación con ratones Wt tratados con EtOH. Las pinzas de parche de células enteras revelan una prolongación del potencial de acción más pronunciada en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH. Mediante estimulación eléctrica programada, los rotores solo se pueden provocar en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH junto con un mayor número y duración de episodios de arritmia ventricular. La presente investigación ayuda a formular una guía de consumo seguro de alcohol para la población con deficiencia de ALDH2 y desarrollar nuevos agentes protectores para estos sujetos.

A pesar de la pesada carga que imponen las enfermedades cardiovasculares y las muertes anuales poco reconocidas entre los grandes bebedores de alcohol y los alcohólicos1, la dosis segura exacta para el consumo de alcohol sigue sin estar clara y varía geográficamente2,3. La asociación entre el consumo de alcohol y la mortalidad cardiovascular parece seguir una curva en J3. Un reciente estudio epidemiológico multiétnico a gran escala mostró que los niveles de ingesta de alcohol que antes se consideraban relativamente inofensivos estaban asociados con un mayor riesgo de muerte prematura4. Los datos experimentales anteriores y los modelos de simulación han relacionado los efectos arritmogénicos relacionados con el alcohol con la exposición aguda a altas dosis de alcohol (concentración de alcohol en sangre >20 mM) o el consumo excesivo de alcohol crónico (≥6 tragos/día). La inestabilidad electrofisiológica inducida por la exposición al alcohol, en las condiciones mencionadas anteriormente, se asocia con homeostasis desregulada del canal iónico, potencial de acción prolongado y excitación de reentrada, todo lo cual resulta en una mayor vulnerabilidad a la arritmia ventricular (VA) y muerte cardíaca súbita5 ,6,7. Actualmente, el umbral tóxico exacto de la ingesta crónica de alcohol y su vínculo mecánico con el desarrollo de AV, una arritmia potencialmente mortal grave pero poco común provocada por la ingesta de alcohol, sigue siendo un tema de controversia8,9.

La aldehído deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2) desempeña un papel fundamental en la desintoxicación del etanol y la cardioprotección contra la lesión por isquemia-reperfusión10,11. La variante ALDH2 rs671, o el alelo ALDH2*2, que codifica una enzima ALDH2 inactiva y causa la reacción de enrojecimiento facial por alcohol, es una de las enzimas más comunes y específicas de la etnia en humanos, que afecta a ~540 millones de asiáticos orientales en todo el mundo12. La variante ALDH2*2 ha ganado mucha atención recientemente debido a su mayor susceptibilidad a los efectos tóxicos del alcohol13,14. Un análisis epidemiológico reciente que investigó las complicaciones cardiovasculares relacionadas con la dosis causadas por el consumo de alcohol indicó que la interpretación de estas relaciones puede estar sesgada debido a la falta de información suficiente sobre los antecedentes genéticos15. Previamente demostramos que la conducción eléctrica ventricular alterada y la reentrada eran mecanismos putativos de proarritmia en modelos animales de alta ingesta de etanol16. Conjeturamos que las características electrofisiológicas desreguladas y los mecanismos de reentrada pueden causar AV con una dosis de alcohol más baja, como <2 tragos estándar/día o un consumo moderado, en humanos que muestran deficiencia de ALDH2. Llevamos a cabo estudios experimentales mecanicistas para explorar la relación entre la deficiencia de ALDH2 y la VA bajo una exposición crónica al alcohol de baja a moderada utilizando un modelo de activación (KI) de ALDH2*2 de ratón. También llevamos a cabo un estudio clínico longitudinal de 5 años para explorar esta relación y el riesgo de arritmia entre una cohorte de 196 sujetos humanos conocidos por su consumo de alcohol de leve a moderado, así como el genotipo ALDH2 rs671.

Entre los 196 adultos con consumo habitual de alcohol de ligero a moderado (mediana: 13,9 [7,6~29,3] g/día, 1,2 [0,6~2,4] bebidas estándar/día), 59 (30,1 %) portaban la variante ALDH2 rs671 ( [ALDH2 Vt]; G/A o A/A), mientras que 137 (69,9 %) eran ALDH2 de tipo salvaje ([ALDH2 Wt]; G/G, Tabla 1). Entre los 57 no consumidores de alcohol, 28 (49,1%) eran ALDH2 Vt y 29 (50,9%) eran ALDH2 Wt. Estos hallazgos indicaron que hasta el 70% de los participantes del estudio clasificados como consumidores habituales de alcohol eran ALDH2 Wt (X2 p = 0,008), mientras que entre los no consumidores de alcohol, la distribución de portadores de ALDH2 de tipo salvaje y variante fue aproximadamente igual ( Tabla 1; Figura complementaria 1b), que se aproximó a la misma distribución de genotipos de ALDH2 (51 % de peso de ALDH2) que se encuentra en la población taiwanesa saludable en general según los datos del Biobanco de Taiwán (https://taiwanview.twbiobank.org.tw). En general, los consumidores habituales de alcohol tenían más probabilidades de ser hombres independientemente del genotipo ALDH2 y mostraron una mayor prevalencia de hipertensión en el grupo ALDH2 Wt. Los consumidores habituales de alcohol (Alc+) demostraron una duración del QRS y un QTc más prolongados en comparación con sus respectivos no consumidores de alcohol (Alc−), independientemente de los genotipos de ALDH2 (ambos p < 0,05) (Tabla 1 y Fig. 1a), con los consumidores habituales de alcohol (Alc+ ) que llevaban ALDH2 Vt mostraron además un QTc significativamente más largo en comparación con los usuarios de alcohol ALDH2 Wt (Alc+) (Fig. 1a). Los modelos de regresión multivariable hacia atrás mostraron que a mayor dosis de consumo de alcohol (coeficiente ajustado: 4,52 [IC 95%: 3,14–5,91], por 10 g+/día, p < 0,001), ALDH2 Vt (coef. ajustado: 7,67 [95% IC: 2,15–13,18], p = 0,003), el sexo femenino, los antecedentes de hipertensión arterial, la enfermedad arterial coronaria (EAC) y la diabetes se asociaron de forma independiente con QTc prolongado (fig. 1b). En particular, los individuos ALDH2 Vt mostraron una mayor pendiente de prolongación del QTc dependiente de la dosis (r = 0,58) en comparación con la de los participantes ALDH2 Wt (r = 0,31) con dosis diarias más altas de consumo de alcohol (interacción ajustada: 0,017) (Fig. 1c ).

Los consumidores de alcohol ALDH2 Vt mostraron un intervalo QT significativamente más largo (corregido al intervalo RR como QTc) en comparación con los no consumidores de alcohol (Alc−) y los consumidores de alcohol ALDH2 Wt (430,1 vs 422,4 vs 415,6 ms en Alc−, Alc+ ALDH2 Wt y Alc+ ALDH2 Vt, respectivamente) (a). El diagrama de caja representa los cuartiles porcentuales 25 y 75, la línea representa la mediana y los bigotes son el 10 % (inferior) y el 90 % (superior). * denota p < 0,05 para Alc+ en comparación con Alc− dentro de cada grupo de genotipo (ya sea ALDH Wt o ALDH Vt). Modelos de regresión de múltiples variables paso a paso hacia atrás que exploran las asociaciones entre las covariables clínicas y el intervalo QTc en el estudio actual (b). Las cantidades más altas de ingesta diaria de alcohol se asociaron con incrementos de QTc más pronunciados en sujetos portadores de ALDH2 Vt (rosa) frente a ALDH2 Wt (azul) (interacción ajustada: 0,017) (c). Las barras en c representan la desviación estándar para QTc y el error estándar para la dosis de alcohol, respectivamente. Las áreas sombreadas representan el área del intervalo de confianza del 95%. *p < 0,05, **p < 0,001 para Alc+ versus Alc− dentro de cada categoría de genotipo (ya sea ALDH Wt o ALDH Vt); #p < 0,05 para Alc+, ALDH Vt frente a Alc+, ALDH Wt.

Se utilizaron ECG de seguimiento en serie y un estudio Holter basado en síntomas para calificar la frecuencia clínica y la gravedad de los AV en los participantes de nuestro estudio. Se identificaron diecisiete participantes del estudio con AV (~7%) durante un período de seguimiento de 5 años. No se encontró ninguno en los no consumidores de alcohol entre los participantes, mientras que 6 (4,4 %) se detectaron en los consumidores habituales de alcohol ALDH2 Wt, y los consumidores habituales de alcohol portadores de ALDH2 Vt mostraron un riesgo casi 4 veces mayor de desarrollar AV significativos (n = 11 , 18,6%) (X2 p < 0,001). Se muestran los modelos de regresión logística multivariable utilizados para examinar los predictores de AV (Tabla 2). Aparte de un historial conocido de CAD, las personas portadoras de ALDH2 Vt tenían un riesgo cuatro veces mayor (odds ratio ajustado: 4,46, IC del 95 %: 1,50–13,23, ALDH2 Wt como referencia) de desarrollar episodios de VA. Una mayor dosis de consumo de alcohol se asoció de forma independiente con un mayor riesgo de AV significativos (odds ratio ajustado: 1,41, IC 95%: 1,13-1,74, por incremento de 10 g/día; Tabla 2), siendo el riesgo más pronunciado en ALDH2 Vt portadores (interacción ajustada: 0,038); (Tabla 2). La presencia de ALDH2 Vt (rs671) no afectó la historia de CAD en términos de desarrollo de AV (interacción ajustada: 0,30). Cuando se utilizó el índice de Youden para la estimación óptima del punto de corte, el umbral de ingesta diaria de etanol para AV significativos en los participantes del estudio de ALDH2 Vt y ALDH2 Wt fue de 9,6 g/día (0,7 bebidas/día) y 14,1 g/día (1,0 bebida/día). ), respectivamente.

Se muestra el protocolo experimental (Fig. 2a). Se determinó la concentración de alcohol en sangre (BAC) en ratones de tipo salvaje (Wt) y ALDH2 * 2 KI alimentados con dietas líquidas normales y EtOH al 4% durante 7 semanas (Fig. 2 complementaria). Los ratones Wt y ALDH2*2 KI tratados con una dieta de alcohol al 4% durante 7 semanas demostraron un ligero aumento en la morfología bruta del grosor de la pared del corazón y el tamaño del corazón, en comparación con los grupos sin dieta de alcohol (Fig. 2b). Se observó una fibrosis intersticial miocárdica más extensa en los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4% en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH al 4% y otros grupos (Fig. 2c, d). Los ratones ALDH2*2 KI alimentados con EtOH al 4 % también mostraron un aumento significativo de la relación peso del corazón/peso corporal (HW/BW) en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH al 4 % y otros grupos (Fig. 2d). Los BAC fueron 0,011 ± 0,001 vol% (2,120 ± 0,281 mM), 0,057 ± 0,007 vol% (9,443 ± 1,102 mM), 0,013 ± 0,002 vol% (2,098 ± 0,270 mM) y 0,068 ± 0,007 vol% (11,58 ± 1,171 mM ) para los grupos de ratones Wt/dieta normal, Wt/dieta EtOH al 4 %, ALDH2*2 KI/dieta normal y ALDH2*2 KI/dieta EtOH al 4 %, respectivamente (Fig. 2 complementaria). En particular, el fenotipo electrocardiográfico de los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % replicó el fenotipo humano, mostrando una marcada prolongación de los intervalos QT (QT y QTc) y la aparición espontánea de AV en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH al 4 % y otros grupos (2 de 7 ratones frente a ninguno en otros grupos de ratones, Fig. 2e-g, j). Se observó una tendencia similar en la pendiente de prolongación de QTc más alta en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH al 4 % a niveles más altos de BAC (pinteracción: 0,035) (Fig. 2k).

Ratones homocigóticos ALDH2*2 KI de cuatro meses de edad (C57BL/6, macho) después de 7 semanas de tratamiento con dieta Alc al 4 % (a). Hallazgos relacionados con la patología en morfología macroscópica representativa y secciones transversales de corazones de ratones de diferentes grupos que muestran una masa miocárdica y un grosor de la pared del VI preservados pero ligeramente más altos en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH (b). Análisis histológico (H&E) con tinción tricrómica de Masson (MT) de secciones de corazón (c). El peso del corazón indexado al peso corporal de los ratones reveló un aumento leve pero significativo en los grupos de ratones tratados con EtOH al 4% (izquierda), particularmente en ratones ALDH2*2 KI, en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal (d). También se observó fibrosis marcadamente extensa (flechas negras) dentro del miocardio (tinción azul claro) en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH (derecha) (d). Ilustraciones del electrocardiograma de superficie corporal (ECG) en el modelo de ratón. Los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % mostraron fenotipos electrocardiográficos de duración QRS más prolongada, intervalo QT (e) y aparición espontánea de VPC frecuentes (flecha negra) (f) en comparación con otros grupos durante 5 minutos de registro ECG continuo. En promedio, QRS y QTc mostraron aumentos del 16 % y del 23,6 % en comparación con ratones Wt con dieta normal en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH (ambos p < 0,05) por ECG de superficie (g–j). Se observó una mayor pendiente de prolongación de QTc en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % (rosa) en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH al 4 % (azul) a niveles más altos de BAC (interacción: 0,035) (Fig. 2k). Las áreas sombreadas representan el área del intervalo de confianza del 95%. Las barras de error representan el error estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para cualquier EtOH al 4 % frente al control de dieta normal dentro de cada grupo de genotipo (ALDH2*2 KI o Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 para EtOH ALDH2*2 KI al 4 % frente a EtOH al 4 % en peso.

A continuación, examinamos la proteína de unión gap, Cx43, y varios canales iónicos/transportadores clave involucrados en la despolarización/repolarización ventricular. La tinción doble de los tejidos miocárdicos con el anticuerpo Cx43 reveló que Cx43 estaba regulado al alza en ratones Wt tratados con EtOH al 4% en comparación con los ratones Wt con dieta normal (Fig. 3a, b). Por el contrario, Cx43 se reguló significativamente a la baja en ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH (36, 6% de reducción, p = 0, 006. Figura 3b). Se alteró la distribución de Cx43 en los cardiomiocitos de ambos ratones tratados con EtOH. Aunque Cx43 se limitó predominantemente a los discos intercalados en ratones Wt con dieta normal, se observó una mayor proporción de marcadores de Cx43 en los bordes laterales de los cardiomiocitos en ambos grupos de ratones tratados con EtOH. Estos hallazgos indicaron una mayor lateralización de Cx43 en los grupos Wt y ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con sus respectivos grupos de control de dieta normal, y los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH mostraron una lateralización de Cx43 más pronunciada en comparación con la de los ratones EtOH- ratones Wt tratados (52,8 % y 67,2 % de aumento en los grupos de ratones Wt tratados con EtOH y ALDH2*2 KI frente a ratones Wt con dieta normal, respectivamente, ambos p < 0,001) (Fig. 3a, c).

La microscopía inmunoconfocal para la tinción doble del miocardio para WGA y Cx43 mostró un área de expresión total de Cx43 significativamente reducida (con y sin corrección del área miocárdica total) en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt y dieta normal tratados con EtOH Grupos de ratones ALDH2*2 KI, con un aumento destacado en la tinción citoplasmática de Cx43 (flechas blancas) (a, b). Se observó un índice marcadamente mayor de redistribución de Cx43 en los bordes laterales de los cardiomiocitos en ambos grupos de ratones tratados con EtOH en comparación con los otros dos grupos de control de dieta normal (a, c), y los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH exhibieron un comportamiento más pronunciado. aumento de la lateralización de Cx43 que los ratones Wt tratados con EtOH. Para cada grupo, se analizaron 13–15 imágenes (3 ratones en cada grupo) (×40, 800 píxeles). Las barras de error representan el error estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para cualquier EtOH al 4 % frente al control de dieta normal dentro de cada grupo de genotipo (ALDH2*2 KI o Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 para EtOH ALDH2*2 KI al 4 % frente a EtOH al 4 % en peso.

El análisis morfológico de varias expresiones de proteínas de canales iónicos entre diferentes grupos de ratones a través de microscopía de inmunofluorescencia se ilustra en la Fig. 3 complementaria. Los cardiomiocitos ventriculares se tiñeron para Nav1.5 (verde), Cav1.2 (verde), Cav1.3 (verde), Kv1.4 (verde), Kv4.2 (verde), Kv4.3 (verde) y WGA (rojo), junto con tinción DAPI (azul). En resumen, la microscopía de inmunofluorescencia indicó que, en comparación con los ratones Wt con dieta normal, los cardiomiocitos de ambos ratones tratados con EtOH mostraron alteraciones morfológicas y remodelación de los canales iónicos, así como patrones de estrías de cardiomiocitos arquitectónicos anormales, que fueron más prominentes en los ratones ALDH2*2 KI. Estos pueden incluir tinción desorganizada de Nav1.5 (punta de flecha blanca), tinción atenuada y pérdida de estrías de Kv1.4 (punta de flecha blanca y asterisco), agregaciones irregulares y tinción atenuada de Kv4.2 (punta de flecha blanca y asterisco), acentuación tinción de Kv4.3 (punta de flecha blanca) y ambos acentuaron Cav1.2 y Cav1.3 aunque la agregación alterada en Cav1.2 (punta de flecha blanca).

Realizamos experimentos cuantitativos de transferencia Western para cuantificar la expresión de proteínas (Fig. 4a-q). La transferencia Western de preparaciones de tejido completo mostró TGF-β1 y colágeno-1 regulados al alza en el miocardio de ratones Wt tratados con EtOH y ratones KI ALDH2*2. Nuevamente, TGF-β1 y colágeno-1 se expresaron de manera más prominente en corazones de ratón ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH (Fig. 4b, c). La expresión de la proteína total de Cx43 se reguló significativamente a la baja en ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH y otros grupos (todos p <0.05) (Fig. 4d). Por el contrario, la expresión de la proteína total Cx43 en ratones Wt tratados con EtOH aumentó en comparación con la de los ratones Wt tratados con dieta normal. Los niveles de expresión de los canales iónicos involucrados en la despolarización y repolarización ventricular se reflejaron en la expresión total de Nav1.5, que aumentó ligeramente en los ratones KI tratados con EtOH Wt y ALDH2*2 en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal (p = 0.034 y 0.028, respectivamente) (Fig. 4e). Tanto Kv1.4 como Kv4.2 se regularon significativamente a la baja en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con los grupos de ratones de control ALDH2*2 KI con dieta normal (p = 0,029 y 0,039, respectivamente), con una expresión de Kv4.2 significativamente más baja observado en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH. Estas diferencias no fueron significativas en los ratones Wt tratados con EtOH frente a los ratones Wt con dieta normal (p = 0,71 y 0,93) (Fig. 4f, g). Kv4.3 se reguló sustancialmente en ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH y otros grupos (Fig. 4h). El Cav1.3 de tipo L se reguló significativamente en ratones Wt tratados con EtOH en comparación con el grupo de ratones Wt con dieta normal (p = 0.044), aunque no se encontraron diferencias significativas para Cav1.2 entre los grupos (Fig. 4i, j). Tanto el intercambiador de sodio-calcio (NCX) como CaMKII (expresión total y sus formas fosforiladas/oxidadas) aumentaron en los tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal, independientemente de los genotipos, siendo CaMKII la proteína regulada al alza más prominente en EtOH ratones ALDH2 * 2 KI tratados (Fig. 4 complementaria).

Análisis densitométrico del tejido cardíaco TGF‐β1/colágeno-1, Cx43 (forma total) y una variedad de proteínas de canales iónicos (incluidas Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 y Cav1 .3) de cuatro grupos de ratones (a–q) mediante transferencia Western. En comparación con los ratones Wt con dieta normal, los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH mostraron una reducción del 40,4 % en la Cx43 total, una reducción del 74,3 % en Kv1.4 y una reducción del 67,2 % en Kv4.2 (d, f, g), respectivamente . Las fracciones citoplásmicas y membranosas de los niveles de expresión de los canales iónicos (k-q) se examinaron por separado para determinar la distribución subcelular de sus alteraciones en ratones que funcionan claramente con ALDH2 alimentados con una dieta normal o con EtOH al 4%. Las barras de error representan el error estándar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para cualquier EtOH al 4 % frente al control de dieta normal dentro de cada grupo de genotipo (ALDH2*2 KI o Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 para EtOH ALDH2*2 KI al 4 % frente a EtOH al 4 % en peso.

Como la fracción de membrana de los canales iónicos sigue siendo el componente funcional fundamental del impulso eléctrico y la generación de potencial de acción, examinamos más a fondo los niveles de expresión de proteínas miocárdicas de la fracción membranosa, por separado de los de la fracción citoplasmática (Fig. 4k-q). Observamos expresiones de Nav1.5 claramente reguladas en ratones tratados con EtOH. Sarcolemal Nav1.5 se reguló notablemente a la baja en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH (p < 0,001); por el contrario, el tratamiento con EtOH condujo a un aumento de Nav1.5 sarcolémico en ratones Wt en comparación con los ratones Wt con dieta normal (p = 0,008) (Fig. 4l). Tanto el sarcolemal Kv1.4 como el Kv4.2 mostraron una marcada regulación a la baja en ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de ratones Wt tratados con EtOH (ambos p <0.05, respectivamente) (Fig. 4m, n). Por el contrario, el Kv4.3 membranoso en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH se incrementó significativamente en comparación con el de los ratones Wt tratados con EtOH y otros grupos (Fig. 4o). Los canales de calcio de tipo L de Cav1.2 y Cav1.3 en la fracción membranosa aumentaron significativamente en los ratones Wt tratados con EtOH en comparación con los ratones de control Wt con dieta normal, aunque estas diferencias no se observaron en los grupos de ratones ALDH2*2 KI. Finalmente, se observaron aumentos significativos de Cav1.3 citoplásmico pero no de Cav1.2 en ambos grupos de ratones tratados con EtOH en comparación con sus respectivos controles de dieta normal, independientemente de los genotipos (Fig. 4p, q).

Se analizaron los cambios dinámicos en la duración del potencial de acción (APD) y la velocidad de conducción (CV) para evaluar los efectos del alcohol en los patrones de propagación eléctrica cardiaca de ratones KI WT y ALDH2*2. Se muestra el potencial de membrana en la superficie epicárdica del ventrículo izquierdo evaluado a través de un registro óptico a una longitud de ciclo de estimulación (PCL) de 300 ms (Fig. 5a). La media de APD70 fue consistentemente más larga en los ratones tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal, independientemente de los genotipos, y en general se observó una APD70 significativamente más alta en los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con la de los ratones Wt tratados con EtOH ( Figura 5b). No hubo diferencias significativas entre los CV de los cuatro grupos diferentes en un PCL de 200 ms. A pesar de un aumento significativo de los CV en los ratones tratados con EtOH en comparación con los ratones Wt con dieta normal, observamos que los CV se redujeron sustancialmente en los ratones tratados con EtOH en comparación con los ratones ALDH2*2 KI con dieta normal en PCL de 250 y 300 ms. Los ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH mostraron CV significativamente más bajos en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH en PCL de 250 y 300 ms (Fig. 5c, d). Estos resultados indicaron que los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH exhibieron APD significativamente prolongado y CV más bajos en PCL más altos.

a Potencial de acción óptica a 300 ms PCL. b APD al 70% de repolarización. c Un ejemplo de propagación eléctrica como mapas de isócronas en el ventrículo a 300 ms PCL. d CV en diferentes PCL; n = 6 en cada grupo; las barras de error son SD; Los valores de p se calcularon usando GraphPad Prism 8.0 con múltiples pruebas t. Duración del potencial de acción de APD, velocidad de conducción CV, duración del ciclo de estimulación del LCP. e Se realizaron registros de ECG y mapeo óptico ventricular simultáneos durante la inducción de AV a partir de un ejemplo de AV maligno en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH. Los ratones Wt tratados con EtOH mostraron solo un episodio de VA con una ligera ruptura de onda y no exhibieron rotaciones durante VA (Figura complementaria 2, Película complementaria 2). Los ratones Wt y ALDH2 * 2 KI alimentados con una dieta normal revelaron una propagación eléctrica suave después de la inducción de PES (Películas complementarias 3 y 4). f Puntos de frecuencia dominante (DF) e instantáneas de la onda espiral correspondientes a la señal óptica en el dominio del tiempo en un punto dado durante la AV con múltiples latidos de AV y sitios de iniciación mostrados (flechas blancas). h, i Cuantificación de episodios de AV inducidos y duración. (n = 6 en cada grupo). Las barras de error representan la desviación estándar; Los valores de p se calcularon mediante pruebas t de Student no apareadas usando GraphPad Prism 8.0. AV arritmia ventricular, estimulación eléctrica programada PES, frecuencia dominante DF.

La susceptibilidad a la arritmia de los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH se probó adicionalmente mediante estimulación programada. Durante la inducción de VA, se observó una alta vulnerabilidad de los AV malignos junto con una actividad de reentrada de alta frecuencia inducible en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH después de PES (11 episodios/6 ratones en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH frente a 0–1 episodio / 6 ratones en otros grupos, todos p <0.05) (Fig. 5e-i; Figs. Suplementarias 5, 6). Usando un mapa de frecuencia dominante, se observaron áreas de alta frecuencia de rotaciones VA y rotores serpenteantes inducibles con múltiples wavelets desorganizadas en 4 de 6 ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH durante latidos VA, pero no en otros grupos (Fig. 5f, g; Figuras complementarias 5, 6; Película complementaria 1). En comparación, solo un ratón Wt tratado con EtOH mostró frentes de onda de activación anormales con AV inducibles (Fig. 6b complementaria; Película complementaria 2), y ninguno de los ratones en el grupo Wt de dieta normal o en el grupo KI ALDH2 * 2 de dieta normal mostró VA inducible (Figuras complementarias 6a, c; Películas complementarias 3, 4). Los ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH tuvieron un número y una duración significativamente mayores de episodios de VA en comparación con los de los ratones Wt tratados con EtOH (Fig. 5h, i). Estos resultados demostraron que el aumento de los episodios de AV, así como las duraciones de AV, recapitularon las principales características proarritmogénicas en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH.

Para determinar si la APD de los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH está alterada, se controlaron los cardiomiocitos aislados utilizando la técnica de pinzamiento de parche. Los cardiomiocitos se marcaron con estímulos despolarizantes por encima del umbral de 5 ms en el modo de pinzamiento de corriente. La APD (al 50 % y al 90 % de repolarización) se prolongó en los cardiomiocitos de los ratones Wt y ALDH2*2 KI tratados con EtOH. Se registraron APD significativamente más largas en APD50 así como en APD90 en cardiomiocitos aislados de ratones tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal independientemente de los genotipos, con los cardiomiocitos ALDH2*2 KI tratados con EtOH exhibiendo APD significativamente más largos que los de los ratones Wt tratados con EtOH (todos p <0.05) (Fig. 6a, b). Esto indicó que la prolongación de APD también corroboró nuestros hallazgos relacionados con el potencial de membrana de mapeo óptico morfológico (Fig. 6a). La principal corriente de despolarización en el ascenso AP (Vmax) de los cardiomiocitos, el Nav1.5 disfuncional, puede actuar para reducir el flujo de entrada de Na+, la propagación lenta del impulso y la heterogeneidad de la conducción del puerto17,18. En el presente estudio, la Vmax en cardiomiocitos aislados de ambos ratones tratados con EtOH disminuyó sustancialmente en comparación con los de sus respectivos controles de dieta normal independientemente de los genotipos (125,9 ± 6,3 frente a 146,9 ± 9,6 9 mV/s para ratones Wt, p = 0,04 97,6 ± 8,0 frente a 140,4 ± 13,9 mV/s para ratones ALDH2*2 KI, p < 0,01), y los cardiomiocitos ALDH2*2 tratados con EtOH exhibieron además una Vmax significativamente menor que la de los ratones Wt tratados con EtOH (p < 0.01, figura 6c). No hubo diferencias significativas entre el potencial de membrana en reposo y la amplitud del potencial de acción de los cardiomiocitos aislados de todos los grupos (Fig. 6d).

Comparaciones de grabaciones superpuestas de APD al 50% y 90% de repolarización (a, b), Vmax (c), potencial de membrana en reposo (RMP) y amplitud del potencial de acción (APA) d entre diferentes grupos de ratones. Vmax fue 97,6 ± 8,0 frente a 140,4 ± 13,9 mV/s para ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH y con dieta normal, respectivamente; y 125,9 ± 6,3 frente a 146,9 ± 9,6 9 mV/s para ratones Wt tratados con EtOH y con dieta normal, respectivamente. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para cualquier EtOH al 4 % frente al control de dieta normal dentro de cada grupo de genotipo (ALDH2*2 KI o Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 para EtOH ALDH2*2 KI al 4 % frente a EtOH al 4 % en peso. n = 8 celdas independientes en cada grupo. Las barras de error representan el error estándar.

Para dilucidar los mecanismos subyacentes a la reducción del potencial de acción de Vmax en cardiomiocitos de ratón tratados con alcohol con o sin mutación ALDH2, comparamos la corriente de sodio de los cardiomiocitos (INa) entre diferentes grupos (Fig. 7a-d). INa fue provocado por un paso de despolarización de 50 ms de −80 mV a +30 mV con un incremento de 5 mV desde un potencial de retención de −80 mV. Las trazas representativas y las relaciones de corriente-voltaje mostraron que el INa en los cardiomiocitos aislados de ambos grupos de ratones tratados con EtOH disminuyó notablemente, especialmente en los derivados de los ratones tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de control con dieta normal (-54,28 ± 5,69 vs −66,87 ± 8,09 pA/pF a −45 mV para ratones Wt, p < 0,05; −32,23 ± 4,42 frente a −66,50 ± 7,93 pA/pF a −45 mV para ratones ALDH2*2 KI, p < 0,001) (Fig. 7b–d). La cinética de INa afectada en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % se analizó usando una curva de inactivación de INa. Se aplicaron diferentes niveles de voltaje de pulsos previos de acondicionamiento (-120 a 30 mV) durante 200 ms para inducir la inactivación del canal, con el fin de examinar la inactivación de INa dependiente de voltaje. Luego se usó un segundo pulso (−30 mV) para despolarizar el potencial de membrana durante 50 ms (Fig. 7a complementaria). Luego, la amplitud de INa se normalizó a la amplitud de corriente máxima (Fig. 7b complementaria), y las trazas se ajustaron utilizando el modelo de ecuación de Boltzmann (Fig. 7c complementaria). Los resultados mostraron que la curva de inactivación de INa en los cardiomiocitos de los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % se desplazó sustancialmente a la izquierda con una pendiente más pronunciada y se observó un V0,5 en comparación con los ratones ALDH2*2 KI con dieta normal o los ratones Wt tratados con EtOH. ratones (ambos p <0,01, respectivamente), lo que indica una cinética de INa diversamente afectada. Sin embargo, los ratones Wt tratados con EtOH solo mostraron un cambio leve pero no significativo en la curva de inactivación de los cardiomiocitos en comparación con los ratones Wt con dieta normal (Fig. 7d complementaria). Por otro lado, la recuperación de INa de la inactivación se determinó usando un protocolo típico de pulsos emparejados. Después de un potencial de retención de −80 mV, se separaron 2 pulsos idénticos de −30 mV durante 30 ms en cada intervalo (0–380 ms) (Fig. 7e complementaria). Se generaron y trazaron corrientes contra intervalos entre pulsos emparejados (Fig. 7f complementaria) y las trazas se ajustaron mediante una sola ecuación exponencial (Fig. 7g complementaria).

INa e ICa se obtuvieron a través de un paso de despolarización de 50 (a) y 400 ms (e), respectivamente, con trazas representativas (b, f para INa e ICa) y relaciones de corriente-voltaje que muestran la densidad de INa e ICa (c, g) entre diferentes grupos de ratones. Densidad de INa marcadamente disminuida de cardiomiocitos en ambos grupos de ratones tratados con EtOH a -45 mV (con la corriente máxima) en comparación con sus respectivos controles de dieta normal independientemente de los genotipos y ratones Wt tratados con EtOH (d). A 0 mV, las densidades ICa de cardiomiocitos en ambos grupos de ratones tratados con EtOH fueron significativamente más bajas, especialmente en ratones ALDH2*2 KI, en comparación con las de sus respectivos grupos de control de dieta normal (h). Los detalles sobre las curvas de inactivación de INa/ICa dependientes del voltaje y la recuperación de INa/ICa de la inactivación entre diferentes grupos de ratones se detallan más en las Figs. 3 y 4. La corriente total de salida de potasio (IK) (i), trazas representativas y relaciones de corriente-voltaje que muestran la densidad transitoria de la corriente de salida de potasio (Ito) entre diferentes grupos de ratones. El Ito se definió como la diferencia entre el pico (Ipeak) y la corriente de estado estable (Iss) (j). Las densidades Ipeak, Iss e Ito (k) se redujeron significativamente en los cardiomiocitos de ambos grupos de ratones tratados con EtOH. Tanto la densidad Ipeak como Ito de los cardiomiocitos fue significativamente menor solo en los grupos tratados con EtOH en comparación con sus respectivos grupos de control de dieta normal del genotipo ALDH2*2 KI. Estas comparaciones no fueron significativas en los grupos de ratones Wt (l). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para cualquier EtOH al 4 % frente al control de dieta normal dentro de cada grupo de genotipo (ALDH2*2 KI o Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 para EtOH ALDH2*2 KI al 4 % frente a EtOH al 4 % en peso. n = 10 celdas independientes en cada grupo. Las barras de error representan el error estándar.

Ambos grupos tratados con EtOH mostraron un desplazamiento a la derecha significativo con una constante de tiempo aumentada (τ) en las curvas de recuperación de la inactivación en comparación con las de sus respectivos grupos de control de dieta normal (p = 0,01 y p < 0,01 para Wt y ALDH2*2 grupos de ratones KI, respectivamente), lo que indica una cinética AP diversamente alterada (Fig. 7h complementaria). En general, los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH mostraron una reducción más significativa de la corriente de sodio de los cardiomiocitos (INa) y una prolongación de la constante de tiempo de recuperación (τ) en las curvas de recuperación de la inactivación en comparación con los ratones Wt tratados con EtOH (Fig. 7b-d; Fig. Suplementaria 7). Investigamos más a fondo el papel de las corrientes de calcio (ICa) en APD y comparamos ICa de cardiomiocitos de diferentes grupos de ratones (Fig. 7e-h). ICa fue provocado por un pulso despolarizante de 400 ms de −38 a +60 mV con un incremento de 2 mV desde un potencial de retención de −40 mV. La densidad de ICa en los cardiomiocitos de ambos ratones tratados con EtOH disminuyó en comparación con la de sus respectivos controles de dieta normal (−6,72 ± 1,28 frente a −8,48 ± 0,5 pA/pF a 0 mV para ratones Wt, p < 0,05; −4,41 ± 0,54 vs. −7.75 ± 0.55 pA/pF a 0 mV para ratones ALDH2*2 KI, p < 0.001) (Fig. 7f-h), nuevamente, con los cardiomiocitos aislados de los ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH mostrando la mayor cantidad disminución pronunciada en su densidad ICa. El tratamiento con alcohol al 4% también desplazó la curva de recuperación dependiente del tiempo hacia la derecha y ralentizó la recuperación de ICa de la inactivación. Para examinar la inactivación de ICa dependiente de voltaje, se aplicaron diferentes niveles de voltaje de pulsos previos de acondicionamiento (−40 a 10 mV) durante 200 ms para inducir la inactivación del canal. Luego se aplicó un segundo pulso (0 mV) durante 100 ms para despolarizar el potencial de membrana (Fig. 8a complementaria). Luego, la amplitud de ICa se normalizó a la amplitud de corriente máxima (Fig. 8b complementaria), y las trazas se ajustaron utilizando el modelo de ecuación de Boltzmann Fig. 8c complementaria). No se observaron cambios significativos entre las curvas de inactivación de ICa de los cardiomiocitos de todos los grupos de ratones (Fig. 8d complementaria). Por otro lado, la recuperación de ICa de la inactivación se determinó utilizando un protocolo típico de pulsos emparejados. Después de mantener un potencial de -40 mV, se aplicaron dos pulsos idénticos de 0 mV de 200 ms de duración con intervalos de 0 a 85 ms entre ellos (Fig. 8e complementaria). Se trazaron las corrientes contra los intervalos entre pulsos emparejados (Fig. 8f complementaria), y las trazas se ajustaron a través de una ecuación exponencial única (Fig. 8g complementaria). La constante de tiempo (τ) aumentó significativamente en los cardiomiocitos de ambos ratones tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos grupos de control de dieta normal independientemente de los genotipos (τ; ambos p <0.01; Fig. 8h complementaria), lo que indica que la repolarización de ICa la cinética fue perturbada significativamente debido al tratamiento con alcohol.

Para aclarar la asociación entre la corriente transitoria de salida de potasio (Ito) y la prolongación de APD en cardiomiocitos de ratones Wt y ALDH2*2 KI tratados con alcohol, comparamos la Ito de cardiomiocitos de diferentes grupos en el modo de fijación de voltaje (Fig. 7i– l). La corriente total de salida de potasio (IK) se obtuvo a través de una despolarización de 5 ms a −40 mV, seguida de un pulso de despolarización de 400 ms de −30 mV a +80 mV, con un incremento de 5 mV a partir de un potencial de mantenimiento de −70 mV . Ito se definió como la diferencia entre la corriente máxima (Ipeak) y la corriente de estado estable (Iss) (Fig. 7j). Las relaciones de corriente-voltaje mostraron que Ipeak, Iss e Ito en los cardiomiocitos de los ratones Wt tratados con EtOH y ALDH2 * 2 KI fueron significativamente más bajos en comparación con los ratones Wt con dieta normal (Fig. 7k). A +80 mV, las densidades Ipeak e Ito de los cardiomiocitos de los ratones tratados con EtOH fueron significativamente más bajas en comparación con las de los grupos de control de dieta normal del genotipo ALDH2*2 KI (23 % y 32 % de reducción, respectivamente), aunque no significativamente diferente entre grupos de ratones tratados con EtOH y con dieta normal de genotipo Wt (Ipeak e Ito: 27,68 ± 3,18 frente a 35,87 ± 2,26 pA/pF y 10,77 ± 1,77 frente a 15,83 ± 1,33 pA/pF para KI tratado con EtOH frente a KI de dieta normal , ambos p < 0,05, 31,79 ± 3,11 frente a 47,52 ± 7,25 pA/pF y 12,45 ± 1,81 frente a 17,87 ± 3,33 pA/pF para peso tratado con EtOH frente a peso con dieta normal, p = 0,08 y 0,15, respectivamente; Fig. 7l ). La densidad Iss de los cardiomiocitos de ambos ratones tratados con EtOH fue comparable a la de su respectivo control de dieta normal, independientemente de los genotipos (Fig. 7l). Ni la inactivación de Ito (Fig. 9a-d complementaria) ni la recuperación (Fig. 9e-h complementaria) de Ito de los cardiomiocitos diferían entre los diferentes grupos. La corriente de potasio del rectificador de entrada (IK1) fue comparable entre los cuatro grupos, lo que respalda el hallazgo de que RMP fue similar en todos los grupos (Fig. 10 complementaria). Tomados en conjunto, nuestro mapeo óptico y simulación que simulan la AV humana, así como los resultados de las mediciones de pinzamiento de parche de los potenciales de acción de una sola célula, indicaron que el genotipo ALDH2*2 KI era el componente característico asociado con la AV en humanos que participan en la luz a la luz. consumo moderado de alcohol.

Se ha propuesto que el umbral para el efecto tóxico del alcohol es significativamente más bajo en sujetos humanos portadores de la variante ALDH2*219. Una reducción en el umbral de seguridad del alcohol ejerce un impacto en la salud, lo que implica implicaciones clínicas para una población estimada de 540 millones que comprende casi el 35%-45% de la población mundial de Asia oriental10,12,13,14. Aquí, informamos que las duraciones de QTc (ALDH2 rs671 G/A o A/A) se prolongaron significativamente en sujetos humanos que consumen alcohol de leve a moderado (dosis media: 12,7 [IQR: 6,3~32,8] g/día, o bebida estándar mediana: 0,9 [IQR: 0,5~2,3] bebidas/día; 1 bebida estándar de EE. UU. = 14 g de alcohol puro) que portan genotipos variantes de ALDH2, en comparación con los consumidores habituales de alcohol que portan el genotipo salvaje de ALDH2 y los no consumidores de alcohol3, 4. Utilizando ratones ALDH2*2 KI a los que se les administró una dieta con un 4 % de alcohol durante 7 semanas, recapitulamos el fenotipo electrocardiográfico humano de prolongación del intervalo QT con vulnerabilidad VA. La vulnerabilidad VA se observó exclusivamente en ratones ALDH2*2 KI vivos alimentados con alcohol y se provocó in vivo en corazones perfundidos con Langendorff derivados de ratones ALDH2*2 KI alimentados con alcohol mediante estimulación eléctrica programada. La inducción de VA en ratones ALDH2*2 KI alimentados con una dosis baja de alcohol pareció depender de la deposición de colágeno miocárdico provocada patológicamente junto con la remodelación distintiva de Cx43 y sarcolemal Nav1.5 que afecta la despolarización. Los mecanismos iónicos de repolarización deteriorados (p. ej., reducción de la densidad de Ito) observados en cardiomiocitos con parche de una sola célula y señalización anormal de CaMKII agravaron aún más la APD prolongada con mayor susceptibilidad de AV en ratones ALDH2*2 KI alimentados con alcohol.

Se ha demostrado que la exposición intensa y aguda al alcohol desencadena varias cascadas patológicas de señalización que conducen a arritmias5,20,21. Aunque se ha demostrado que el consumo excesivo de alcohol crónico causa arritmias potencialmente mortales, aún no está claro si la deficiencia de la enzima ALDH2 contribuye a las características electrofisiológicas desfavorables en un umbral de seguridad más bajo en comparación con aquellos sin deficiencia de ALDH2. Sobre la base de un período de observación de 5 años que se llevó a cabo como parte del presente estudio, encontramos que el nivel de umbral que relaciona la exposición diaria de etanol con el riesgo de desarrollar AV clínicos estaba por debajo de 1,0 bebida estándar por día (9,6 g/día o 0,7 bebidas/día) para humanos portadores de variantes de ALDH2 en comparación con sujetos humanos normales con ALDH2 (14,1 g/día o 1 bebida/día). Este hallazgo sugiere que los portadores de la enzima ALDH2 inactiva que consumen niveles de bebidas alcohólicas de leves a moderados pueden enfrentar eventos de VA potencialmente mortales. Además, las personas que portaban la forma inactiva de ALDH2 tenían más probabilidades de experimentar resultados extremadamente desfavorables debido a la susceptibilidad de VA. De acuerdo con estos hallazgos, el estudio actual indicó que los episodios de VA de alto riesgo junto con la formación de rotores por mapeo óptico (Fig. 5h, i) solo fueron inducibles en ratones ALDH2 * 2 KI tratados con una dieta que incorporaba EtOH al 4%, una dosis que es ligeramente inferior a una dieta que incorpora la dosis moderada de alcohol aceptada de EtOH al 5%, informada por otro estudio22. En comparación con los ratones Wt alimentados con una dieta de EtOH al 6 % de forma continua durante 14 semanas, lo que demostró alteraciones electrofisiológicas prominentes en un estudio anterior nuestro, los ratones Wt alimentados con una dieta de EtOH al 4 % durante 14 semanas continuas mostraron solo efectos electrofisiológicos ventriculares modestos sin VA16 provocable. En particular, el BAC de 40–50 mg/dL (8–12 mM) en nuestros ratones Wt tratados con EtOH al 4% correspondió a la dosis modesta en humanos23 y la exposición ligera a moderada al alcohol en modelos experimentales de ratón C57BL/624. Esta concentración de alcohol también se consideró una dosis baja (2-20 mM) con respecto a los efectos sobre el sistema nervioso central relacionados con el alcohol23. En otro estudio, el efecto agudo de la prolongación de APD en cardiomiocitos ventriculares humanos utilizando un modelo de simulación solo se observó a una concentración alta de etanol de 80 mM25, mientras que la prolongación de APD en cardiomiocitos de ratón derivados de ALDH2*2 se observó a un umbral más bajo de 12 mM etanol.

Los hallazgos del estudio actual indicaron que Cx43 aumentó en ratones Wt tratados con EtOH al 4 % durante 7 semanas. Sin embargo, observamos que Cx43 se reguló significativamente a la baja en ratones Wt con tratamiento con EtOH al 4 % durante 14 semanas continuas en nuestro trabajo anterior16 y en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH al 4 % durante solo 7 semanas en el presente estudio, lo que quizás indica que La deficiencia de ALDH2 aceleraría la anomalía de Cx43 con la misma dosis de exposición al etanol. Como se informó en un estudio anterior nuestro, Cx43 se reguló positivamente en ratones C57BL/6 J de tipo salvaje que recibieron alcohol al 36 % como la única fuente de líquido bebible26. Sin embargo, los grupos de ratones Wt y ALDH2*2 KI tratados con EtOH mostraron una lateralización mejorada de Cx43 (Fig. 3c), lo que probablemente promovió la formación de hemicanales no interseccionales y facilitó la fuga de corriente con una dinámica mejorada de Ca2+27,28. Estas características de remodelación arritmogénica de Cx43 combinadas con fibrosis intersticial provocada, deterioraron aún más el acoplamiento de célula a célula y contribuyeron en parte a la propagación de impulsos dispersos que conducen a una CV más lenta y promovieron la reentrada con efectos proarrítmicos17,29,30. La remodelación modesta de Cx43 junto con factores que influyen en la conducción eléctrica (p. ej., Vmax reducida) también puede ser arritmogénica. Además, la regulación a la baja de Nav1.5 (o INa) con una fase 0 más lenta también puede contribuir a la prolongación de APD17,18. Por lo tanto, examinamos más a fondo INa en ratones ALDH2 * 2 KI tratados con EtOH usando parche de sujeción de cardiomiocitos unicelulares aislados29. Un estudio previo nuestro ha demostrado que la administración de EtOH al 4 % durante 14 semanas ejerció efectos moderados, como la reducción del sarcolema Nav1.5 (~30 %) y la disfunción, en ratones C57BL/6 WT16. En comparación, la reducción de Nav1.5 membranoso e INa fue más pronunciada en ratones ALDH2*2 KI en comparación con ratones Wt tratados con EtOH tratados con EtOH al 4 % durante 7 semanas, aunque tanto los ratones Wt tratados con EtOH como los ratones ALDH2*2 KI mostraron disminución de la Vmáx y alteración del flujo de entrada de Na+ con propiedades de activación anormales compartidas en comparación con sus respectivos controles de dieta normal en nuestro estudio de pinzamiento de parche. Además, dado que tanto el potencial de membrana en reposo como IK1 pueden influir en Vmax e INa, los valores comparables de estas pruebas (Fig. 6d y Fig. 10 complementaria) indicaron que la reducción observada en Vmax y la disminución de INa pueden atribuirse a una regulación a la baja excesiva de Nav1. 5 (como se observa en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH) o a la disfunción interna de Nav1.5. En general, estos hallazgos también sugieren que Cx43 y Nav1.5 desregulados en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH condujeron a una pérdida más profunda de la reserva de conducción durante la despolarización, proporcionando así sustratos electrofisiológicos que favorecen el inicio de la formación de circuitos de reentrada y VA episodios

Las proteínas del canal iónico Kv, especialmente Ito, pueden desempeñar un papel fundamental en la determinación de la DPA de los cardiomiocitos, ya que la corriente de potasio rectificadora de entrada (IK1) fue comparable entre diferentes grupos de ratones en nuestro estudio29,31. En particular, tanto Kv1.4 como Kv4.2 desempeñan un papel esencial como canales iónicos responsables de la repolarización ventricular en ratones con Kv4.2 que actúa como la proteína del canal iónico Kv ventricular dominante32,33,34. Por lo tanto, la expresión de Kv4.2 regulada a la baja condujo aún más a una disminución de Ito,f ya una prolongación de APD35. En el presente estudio, tanto el sarcolema Kv1.4 como el Kv4.2 se redujeron notablemente en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH en comparación con los de sus respectivos ratones Wt tratados con EtOH, lo que indica una disfunción crítica en Ito y en los procesos de repolarización de ALDH2. deficiencia enzimática expuesta a EtOH que puede facilitar la formación de sustrato de arritmia. Por el contrario, Kv4.3, un canal Ito,f de funcionamiento menor en ratones, parecía haber sido claramente regulado en nuestros ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH para compensar el Kv4.2 suprimido o el Ito disminuido, como se informó en otros estudios33 ,36. También se sabe que el Kv4.3 regulado al alza contrarresta las consecuencias de los AV fatales inducidos por la dispersión eléctrica de CaMKII hiperactivado y la señalización posterior con un intento de revertir la remodelación eléctrica/estructural ventricular en ciertas afecciones cardíacas patológicas37,38,39. Sin embargo, la homeostasis defectuosa de Ca2+ debido a la sobreexpresión de CaMKII causada por el tratamiento con alcohol en ratones ALDH2*2 KI probablemente activa la señalización descendente dependiente de CaMKII (p. ej., activación del intercambiador de sodio-calcio)40 al generar una corriente despolarizante interna que contribuye aún más a la prolongación de AP41, 42. De acuerdo con hallazgos previos que indican que el acetaldehído acumulado puede inhibir el ICa, a través de múltiples mecanismos, por ejemplo, alteración de la homeostasis del Ca2+ intracelular al favorecer directamente la fuga de Ca2+ mediada por RyR2 y la inhibición de RyR2, alteración de la fosforilación de Ca2+ o fuga de Ca2+ mediada por SERCA de Activación de CAMKII, lo que limita la cantidad de Ca2+ que se liberará del retículo sarcoplásmico tras la estimulación. Por lo tanto, especulamos que tales efectos también pueden ser posibles y agravados en condiciones de ALDH2*2 KI21,43,44,45. La curva de activación de ICa más lenta y desplazada a la derecha (Fig. 7g), junto con una constante de tiempo de recuperación más lenta (τ) de la inactivación (Fig. 8 complementaria), puede predisponer a los cardiomiocitos a la prolongación de AP, lo que aumenta la propensión a las arritmias. Consideradas en conjunto, es probable que estas características actúen de manera simultánea y sinérgica para promover la formación de rotores y sustratos arritmogénicos repolarizantes con mayor vulnerabilidad de AV durante la estimulación programada en ratones ALDH2*2 KI tratados con EtOH46 al 4 %. Se necesitan estudios futuros para demostrar si estos mecanismos y las perturbaciones eléctricas son las causas subyacentes del aumento de la susceptibilidad de los sujetos humanos portadores de ALDH2 * 2 que se involucran en el consumo crónico de alcohol de leve a moderado, a las arritmias.

En resumen, nuestros hallazgos abordan la brecha de conocimiento actual relacionada con los umbrales de seguridad del alcohol necesarios para prevenir AV en sujetos humanos portadores de ALDH2 Wt y aquellos portadores de la variante inactiva ALDH2 * 2 intolerante al alcohol común. Hasta donde sabemos, este es también el primer estudio que proporciona datos completos relacionados con las propiedades electrofisiológicas ventriculares de los portadores de las variantes Wt ALDH2 y ALDH2*2 que están expuestos de forma crónica a niveles de alcohol que van desde leves a moderados. Demostramos que la prolongación fenotípica de la APD vinculada a los AV en sujetos humanos conocidos por portar la variante ALDH2*2, así como por una ingesta de alcohol de ligera a moderada, corrobora plenamente los hallazgos de nuestros estudios en animales usando ratones ALDH2*2 KI tratados con una dosis baja correspondiente dosis de alcohol. Los estudios mecanicistas han mostrado sustratos de reentrada ventricular con formación de rotor mediante mapeo óptico. A nivel molecular, se encontró que una amplia gama de canales iónicos y remodelación de conexinas impulsan corrientes de despolarización/repolarización disfuncionales, lo que conduce a una mayor susceptibilidad a los AV (Fig. 8). Estos hallazgos indican que el genotipo ALDH2*2 es el componente susceptible de AV en humanos con consumo de alcohol de leve a moderado y subraya el riesgo de AV letales inducidos por el consumo de alcohol de bajo a moderado. La interpretación de los hallazgos del estudio actual debe ser cautelosa, ya que nuestro modelo de ratones experimentales se trató con una dieta con un 4 % de alcohol como única fuente de alimento, lo que puede variar del patrón y la frecuencia del consumo de alcohol en humanos. Dado que ALDH2 * 2 afecta a una gran población mundial que consta de 540 millones de asiáticos orientales, muchos de los cuales son bebedores habituales de alcohol de leve a moderado, nuestros hallazgos pueden justificar la confirmación a través de más estudios epidemiológicos a gran escala en el futuro. La base de datos de agregación del genoma humano (gnomAD, https://gnomad.broadinstitute.org/)47 ha compilado recientemente variantes sin sentido de ALDH2 asiáticas, distintas de la variante ALDH2*2. Varias de estas variantes de ALDH2 han mostrado una actividad metabolizadora de alcohol reducida in vitro47. Es probable que los portadores de dichas variantes de ALDH2 en otros grupos étnicos también se vuelvan vulnerables a los eventos de AV a través del consumo de alcohol de bajo a moderado. Asimismo, nuestro trabajo reciente también mostró que las variantes de ALDH2 son propensas al desarrollo de fibrilación auricular y alteración de la función auricular con el consumo de alcohol de leve a moderado48. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de que los formuladores de políticas de salud pública evalúen y formulen pautas de consumo seguro de alcohol para un gran segmento de la población afectada con deficiencia de ALDH2. Se han descubierto activadores de enzimas de molécula pequeña de ALDH2*2, como Alda-111. Desde un punto de vista preventivo, tales compuestos pueden servir como agentes protectores para sujetos portadores de la variante ALDH2*2, que consumen alcohol con frecuencia o son adictos al alcohol.

Cambios en las propiedades electrofisiológicas cardíacas en condiciones de (1) tipo salvaje (Wt) sin uso de EtOH (panel izquierdo), (2) Wt con uso de EtOH (panel central) y (3) variante ALDH2 (polimorfismo) con uso de EtOH ( panel derecho).

Reclutamos prospectivamente a 268 participantes del estudio de nuestras clínicas ambulatorias a través de un cuestionario estructurado sobre el consumo habitual de alcohol. El genotipado ALDH2 SNP rs671 se realizó en 260 participantes del estudio, de los cuales 256 completaron la información demográfica clínica, luego de la selección basada en criterios de exclusión (Figura complementaria 1a). Recopilamos resultados de ECG de superficie corporal de 12 derivaciones, datos antropométricos (como altura corporal, peso y circunferencia de la cintura), información bioquímica (incluidos perfiles de lípidos y función renal definida como eGFR utilizando la fórmula MDRD) e antecedentes médicos, incluida la presencia de hipertensión, diabetes tipo 2, tratamiento de hiperlipidemia, CAD y medicamentos asociados utilizados por todos los participantes. Todos los participantes de nuestro estudio estaban libres de insuficiencia cardíaca y no tenían condiciones médicas urgentes. El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en el estudio. Estos participantes fueron seguidos durante al menos cinco años con respecto al consumo de alcohol. Nuestros cuestionarios y encuestas indicaron que su patrón de consumo de alcohol se mantuvo estable durante al menos 5 años. La dosis de ingesta diaria de alcohol se estimó mediante un cuestionario estructurado en el que se autoinformaron los diferentes tipos de bebidas alcohólicas consumidas, así como las cantidades y la frecuencia de consumo49. En resumen, se pidió a los participantes del estudio que indicaran con qué frecuencia consumían cerveza, licor, vino y vino fuerte, así como la cantidad consumida en cada ocasión. El consumo semanal de alcohol de cada participante se calculó en gramos de alcohol puro multiplicando el producto de la frecuencia de cada bebida alcohólica consumida y la dosis exacta de etanol (derivada de la cantidad y la concentración de etanol [es decir, 3,5–4,5 % para la cerveza], por la gravedad específica del etanol (0,79 g/ml) en cada tipo de bebida alcohólica) de la siguiente manera:

Los participantes del estudio se clasificaron como no consumidores de alcohol (definidos como aquellos que no consumían bebidas alcohólicas o que consumían <14 g de alcohol (equivalente a 1 bebida estándar) semanalmente) y consumidores habituales de alcohol (aquellos que consumían >1 bebida estándar/semana). Para centrarse en los sujetos humanos con un consumo de alcohol entre ligero y moderado, se excluyeron 3 (que se clasificaron como grandes bebedores de alcohol (consumo de alcohol ≥90 g/día o 6,4 tragos/día) de los 256 participantes iniciales del estudio. Este resultó en un total de 253 participantes del estudio, incluidos 196 consumidores habituales de alcohol de leve a moderado, que ingresaron a nuestro análisis final y seguimiento (Fig. S1A).Estos 196 consumidores habituales de alcohol de leve a moderado y 57 no consumidores de alcohol se clasificaron además en dos grupos de acuerdo con sus genotipos ALDH2 de la siguiente manera: ALDH2*1 de tipo salvaje (Wt) y variante de ALDH2 (ALDH2 GA o genotipo AA) (ALDH2 Vt) (Tabla 1). Este estudio pasó la Junta de Revisión Institucional de MacKay Memorial Hospital (14MMHIS069) y cumplió con la Declaración de Helsinki.Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Cada participante del estudio recibió un registro de ECG de superficie corporal estandarizado de 12 derivaciones (Page Writer Trim III; Philips, Andover, MA, EE. UU.). Los parámetros relacionados con el intervalo PR, la duración del QRS y los intervalos QT (con y sin corrección del intervalo RR: QTc) se obtuvieron y analizaron automáticamente a través del software con la velocidad del papel establecida en 50 mm/s, lo que permitió un índice QRSd y QT preciso y confiable. medidas.

Los ECG de referencia y en serie se realizaron anualmente o se siguieron dos veces al año en clínicas ambulatorias durante un máximo de 5 años. Además, la monitorización Holter (durante 24 horas continuas) se organizó en función del juicio clínico de los cardiólogos y los síntomas clínicos (es decir, palpitaciones, mareos o malestar torácico) o signos (p. ej., sospecha de arritmias) de los participantes del estudio. La AV clínica se definió como > 1 contracción ventricular prematura en un solo registro de ECG de 10 segundos o > 30 contracciones ventriculares prematuras en una hora (promediado por registro de 24 horas) al inicio o durante el seguimiento (hasta 5 años), que se asocia con una mayor tasa de muerte súbita cardíaca50.

El estudio animal ALDH2*2 KI cumplió con las pautas institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Ley de Protección Animal de Taiwán; Aplicación Científica de los Animales, 1998). Todos los animales utilizados en este estudio (ratones homocigóticos ALDH2*2 y sus compañeros de camada de tipo salvaje) tenían antecedentes genéticos C57BL/6, y los protocolos fueron revisados ​​por la junta institucional (MMH-AS-107-69). Se asignaron ratones C57BL/6 macho de tipo salvaje o ratones homocigotos ALDH2*2 KI de cuatro meses de edad a dos grupos de dieta16. Estos fueron, (i) el grupo de dieta normal (dieta líquida ad libitum; mezcla seca #F1259SP Bio-Serv® Advancing Science. Enriquecimiento de animales, prueba de EE. UU. con agua tibia del grifo); y (ii) el grupo de EtOH al 4% (dieta líquida de alcohol al 4% v/v; mezcla seca #F1697SP, Bio-Serv® suplementado con maltosa-dextrina, etanol y agua tibia del grifo). La dieta líquida siguió siendo la única fuente de líquidos y alimentos a la que los ratones tuvieron acceso durante 7 semanas continuas. En total, el diseño de nuestro estudio consistió en cuatro grupos de ratones: (i) peso/dieta normal, (ii) peso/4 % de EtOH, (iii) ALDH2*2 KI/dieta normal y (iv) ALDH2*2 KI/4 % EtOH. En el grupo de dieta normal, la maltosa-dextrina se sustituyó isocalóricamente con etanol. Una hora después de la alimentación, todos los ratones fueron sacrificados bajo anestesia profunda y se extrajo sangre venosa y se recolectó de la cola (0.1–0.2 ml). Las muestras de suero se recolectaron y centrifugaron, y el plasma se almacenó a -80 °C. Los BAC se determinaron utilizando un kit de ensayo de etanol EnzyChrom™ (ECET-100, BioAssay Systems). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Junta de Revisión Institucional del MacKay Memorial Hospital. Los ratones fueron sacrificados mediante anestesia con isoflurano con perfusión transcardial con solución salina. Se muestra un esquema del estudio con ratones (Fig. 1).

El ECG de superficie corporal se realizó bajo anestesia con isoflurano al 1-2% (FORANE, ABBOTT Laboratories Ltd., Inglaterra) en una combinación de oxígeno y óxido nitroso mezclado con aire en una proporción de 50:50. Tras la estabilización, nuestros ratones experimentales se sometieron a exámenes ECG detallados de la superficie corporal (a una frecuencia cardíaca de ~450–550 latidos/min) con electrodos conectados a un sistema de monitorización Biopac (Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, EE. UU.). El ECG de superficie corporal se realizó utilizando electrodos de ECG insertados subcutáneamente en las cuatro extremidades, y se adquirieron registros de ECG secuenciales a una velocidad de barrido de 2 kHz durante 10 min. Los resultados del ECG de los ratones se almacenaron como datos sin procesar y se registraron al inicio (16 semanas de edad) y al final del estudio (23 semanas de edad) antes del sacrificio. Los datos se almacenaron para el análisis fuera de línea usando 2 scripts personalizados de MATLAB analizados usando software comercializado (Biopac Student Lab Analysis 4.1.0) que cubre 30–35 latidos del corazón. El intervalo PR se midió desde el comienzo de la onda P hasta el pico de la onda R. El intervalo QRS se midió desde el comienzo de la onda Q hasta el punto en el que la onda S cruzó el punto de referencia. El intervalo QT se midió desde el comienzo de la onda Q hasta el punto en el que la onda T disminuyó al 90 % (T90) desde el pico. Los valores QT corregidos de la frecuencia cardíaca adaptativa se derivaron utilizando una modificación de la fórmula de Mitchell para el ECG murino como:

Con el fin de analizar la morfología miocárdica de Cx43 y los patrones de remodelación, se tomaron imágenes de Cx43 inmunomarcadas de muestras de miocardio y se examinaron mediante microscopía de barrido láser confocal utilizando un Leica TCS SP equipado con un láser de argón/criptón. La remodelación morfológica y estructural de varias proteínas de canales iónicos, incluidas Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 y Cav1.3, se examinó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los corazones de ratón se perfundieron primero con solución salina normal. Todas las muestras ventriculares se incluyeron posteriormente en solución de OCT y se almacenaron a -80 °C. El tejido congelado se cortó en secciones de 3 µm y se fijó con paraformaldehído al 4 %, se permeabilizó con Triton X-100 al 0,5 % durante 30 min y luego se bloqueó en una solución de bloqueo (albúmina sérica bovina al 0,1 % y Triton X-100 al 0,1 % en solución de fosfato de Dulbecco). solución salina tamponada) durante una hora. También se realizó tinción doble de aglutinina de germen de trigo y conexina 43 para la detección de remodelado cardíaco. Se utilizó WGA conjugado con FITC (Vector, Burlingame, CA, EE. UU.) para detectar los bordes celulares. Se usó anticuerpo anti-Cx43 (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.) para detectar Cx43. Se usó burro anti-conejo Cy3 (Chemicon, California, EE. UU.) para visualizar la conexina 43 inmunomarcada (Cx43).

Para canales iónicos y marcaje doble WGA, Nav1.5 (1:200, conejo policlonal, Alomone Labs), Cav1.2 (1:100, conejo policlonal, Alomone Labs), Cav1.3 (1:100, conejo policlonal, Alomone Labs), Cav1.3 (1:100, conejo policlonal, Alomone Labs), Kv1.4 (1:100, policlon de conejo, Alomone Labs), Kv4.2 (1:100, policlon de conejo, Alomone Labs) y Kv4.3 (1:100, policlon de conejo, Alomone Labs). se incubaron durante la noche a 4 °C, seguido de etiquetado con cabra-anti-conejo Alexa 488 (1:400, Invitrogen). Y al día siguiente, los conjugados de WGA con Alexa 594 (1:500, Invitrogen) se incubaron durante 2 horas a 25 °C. Todas las secciones se montaron con un DAPI que contenía antidesvanecimiento.

Las imágenes se recolectaron utilizando una lente de objetivo de 40x y un zoom de 1.0 para la tinción Cx4.3/WGA; zoom 4.0 para canal iónico/tinción WGA de configuración de computadora. Cada imagen grabada constaba de 1024 × 1024 píxeles. Se tomaron vistas de proyección de cuatro secciones ópticas consecutivas a intervalos de 0,25 o 1 μm en el medio de las secciones y se registraron para el análisis. Todas las imágenes fueron procesadas con el software ImageJ o Adobe Photoshop CS6.

El análisis de imágenes de Cx43 se realizó utilizando el software de análisis de imágenes QWIN (Leica) para el análisis de la distribución miocárdica de Cx43, y se obtuvieron la siguiente información y evaluaciones de cada grupo de ratones, incluido (i) el área total de Cx43 inmunomarcado (por corte de imagen), ( ii) el área total de Cx43 inmunomarcada por área de cardiomiocitos, y (iii) el porcentaje de área de Cx43 inmunomarcada a lo largo de los bordes laterales dividido por el área total de proteínas Cx43 inmunomarcadas en cardiomiocitos individuales.

Transferencia Western de preparaciones de tejido completo a partir de muestras de tejido miocárdico para Cx43 (incluidas las isoformas totales, fosforiladas [funcionales] [p-Cx43] y no fosforiladas [np-Cx43] de Cx43), proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina ( CaMKII, tanto en forma total como oxidada [ox-CaMKII]), canales iónicos y proteínas transportadoras de iones relevantes responsables de la generación de potencial de acción se llevó a cabo utilizando anticuerpos apropiados. Las fracciones citoplasmáticas y membranosas de canales iónicos clave o proteínas que están asociadas con propiedades electrofisiológicas se analizaron más a fondo. Las muestras de tejido de la pared libre del ventrículo izquierdo (como preparaciones de tejido completo) a partir de nitrógeno líquido se lisaron usando tampón de lisis celular NP40 al 1 %, que contenía una tableta de cóctel de inhibidor de fosfatasa (Roche) y una tableta de cóctel de inhibidor de proteasa (Roche), y se homogeneizaron mediante sonicación. . Las proteínas citoplásmicas y de membrana de la pared libre del ventrículo izquierdo se prepararon utilizando un kit de extracción de proteínas del compartimento CNM (K3012010, BioChain, EE. UU.). La proteína total se estimó utilizando el método de Lowry (DC Protein Assay Kit, Bio-Rad, EE. UU.).

La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida se realizó utilizando minigeles hechos con un 5 % de geles de apilamiento y un 10-12 % de geles de separación. A continuación, se mezclaron 30–40 µg de cada proteína tisular, 100 µg de fracción de citoplasma o 50 µg de fracción de membrana con tampón de muestra (2,5 % de 2-mercaptoetanol y 1 % de azul de bromofenol) para producir un volumen final de 20–30 µL, cargado en cada carril, sometido a electroforesis (80 V para correr en gel de apilamiento y 120 V en gel de separación; voltaje constante) y transferido (80 V, voltaje constante durante 150 min en hielo). La membrana de PVDF (Perkin Elmer, EE. UU.) se detectó utilizando anticuerpos primarios específicos para colágeno-1 (1:1000, monoclonal de ratón, Sigma), Cx43 (1:250, monoclon de ratón, BD Biosciences), Cx43 (1:1000, policlon de conejo , Sigma-Aldrich) para reconocer la forma fosforilada (funcional) (p-Cx43) y las isoformas no fosforiladas (np-Cx43 [Cx43-P0]) de Cx43. TGF-beta 1 (1:500, monoclon de ratón, Santa Cruz), Nav1.5 (1:200, clon policlonal de conejo, Alomone Labs), Kv1.4 (1:200, clon policlonal de conejo, Alomone Labs), Kv4. 2 (1:200, policlon de conejo, Alomone Labs), Kv4.3 (1:200, policlon de conejo, Alomone labs), Cav1.2 (1:250, policlon de conejo, Alomone Labs), Cav1.3 (1:250 , monoclon de ratón, Gene Tex), NCX1 (1:1000, monoclon de ratón, Gene Tex), p (Thr286)- proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII) (1:2000, monoclonal de ratón, Gene Tex), buey -CaMKII (1:1000, clon policlonal de conejo, Gene Tex) y CaMKII total (1:1000, clon policlonal de conejo, Gene Tex) a 4°C durante la noche. Las transferencias se incubaron adicionalmente con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. La inmunorreactividad se visualizó utilizando una solución ECL (Perkin Elmer, EE. UU.) para desarrollar las imágenes. Para normalizar los niveles de expresión, se extrajeron transferencias y se incubaron con anticuerpo anti-GAPDH (1:50 000, monoclonal de ratón, Sigma-Aldrich), que se usó como control interno. Para normalizar los niveles de expresión de la proteína de membrana, utilizamos la proteína marcadora de membrana Na+ K+- ATPasa (1:1000, Rabbit polyclonal, Cell Signaling) como control interno. Para la transferencia de Western, se realizaron exploraciones y análisis densitométricos cuantitativos en las transferencias utilizando el sistema de imágenes MultiGel-21 (TOPBIO CO. Taiwán) para desarrollar imágenes y el software Gel-Pro para el análisis. Las versiones originales sin recortar de estos análisis estaban disponibles en las Figs. complementarias. 11–15.

Los ratones fueron sacrificados bajo anestesia para el mapeo ex vivo de VA. Los corazones se extirparon inmediatamente mediante toracotomía y se perfundieron con solución de Tyrode oxigenada tibia (pH 7,4; 95 % O2, 5 % CO2, 36–38 °C). Se colocó un electrodo de Ag/AgCl en el VI cerca del vértice, mientras que otro se adjuntó a la superficie del ventrículo derecho para registrar el ECG. El corazón de ratón aislado se tiñó con un colorante sensible al voltaje (Di-4-ANEPPS, 100 μmol/L, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para registrar los potenciales de membrana óptica después de 10 minutos de estabilización. La blebbistatina (5–10 μmol, TOCRIS, Bristol, Reino Unido) se agregó directamente a la solución de Tyrode para reducir los artefactos de movimiento. Los corazones se iluminaron uniformemente con un diodo emisor de luz verde a una longitud de onda de 505 ± 20 nm para activar Di-4-ANEPPS. Las imágenes de fluorescencia se capturaron a través de un filtro de paso largo de 600 nm usando una cámara CMOS (1000 cuadros/segundo, SciMedia, EE. UU.). La vulnerabilidad a la AV inducida por marcapasos se evaluó mediante estimulación eléctrica programada a través de diez ciclos de marcapasos en ráfaga (20 Hz, 10 s) que era el doble del umbral de excitación del ventrículo izquierdo para cada ratón. La frecuencia dominante de las señales ópticas durante la VA inducida en cada ubicación del área mapeada se registró y calculó utilizando la transformada rápida de Fourier. Se construyó un mapa de frecuencia dominante utilizando la frecuencia dominante de todos los píxeles.

La técnica de pinzamiento de parche de células completas se utilizó para registrar el potencial de membrana y las corrientes iónicas con un amplificador Axon CNS 700 B (Molecular Devices, CA, EE. UU.), el sistema de adquisición de datos Digidata 1550 A y el software pClamp (Versión 10, Molecular Devices) en Modos de pinza de corriente y tensión. Los miocitos del ventrículo izquierdo se aislaron enzimáticamente utilizando la técnica de perfusión cardíaca de Langendorff. Los corazones de los ratones se perfundieron retrógradamente con tampón de Krebs (NaCl 120 mM, glucosa 12 mM, NaHCO3 25, KH2PO4 1,2, MgSO4 1,2 y KCl 5,4). Después del equilibrio, se perfundieron 0,4 mg/ml de colagenasa (tipo II, Worthington) en tampón Krebs durante 20 minutos Se cortaron corazones de ratón en trozos pequeños y se filtraron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Gibco).

Las células quiescentes se colocaron en una cámara montada en la platina de un microscopio invertido (Eclipse Ti-U, Nikon Corporation, Japón) en una solución de baño que contenía 137, 5,4, 1,8, 1,1, 6, 22 y 0,33 mM de NaCl, KCl , CaCl2, MgCl2, HEPES, glucosa y NaH2PO4, respectivamente. El pH se ajustó a 7,4 usando NaOH. Para los experimentos destinados a detectar INa, se usó N-metil-D-glucamina (91 mM) para reemplazar concentraciones iguales de NaCl. En experimentos específicos, se agregaron Cs+ (2 mM) y Co2+ (1 mM) para bloquear las corrientes de potasio y calcio, respectivamente. Se prepararon electrodos de vidrio pulidos con calor (resistencias de punta de aproximadamente 2 MΩ cuando se llenaron con una solución interna a través de una pipeta) a partir de capilares de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor de microelectrodos de vidrio (PC-10, Narishige International Inc., East Meadow, Nueva York, EE. UU.). La solución interna contenía KCl 120 mM, MgCl2 5 mM, MgATP 5 mM, HEPES 10 mM y EGTA 15 mM; El pH se ajustó a 7,2 utilizando KOH a temperatura ambiente. Para las mediciones de INa e ICa, se agregaron Cs+ y tetraetilamonio (TEA) a la solución de la pipeta.

Se usaron ensayos de genotipado de SNP TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para realizar el genotipado de ALDH2 de todos los participantes humanos, mientras que se usó la secuenciación de ADN por PCR directa para determinar los genotipos de nuestros ratones experimentales en nuestro estudio. En los genotipos humanos, tanto el genotipo ALDH2 rs671 GA como el AA se definieron como portadores de la variante ALDH2 (ALDH2 Vt). La ausencia del alelo variante A de ALDH2 rs671 o del genotipo GG se definió como portador de ALDH2 de tipo salvaje (ALDH2 Wt). El ADN genómico se extrajo de muestras de sangre entera que contenían EDTA obtenidas de cada participante mediante un sistema de extracción semiautomático (Smart LabAssist, Taiwan Advanced Nanotech Inc., condado de Tau-Yuan, Taiwán) equipado con una placa de ADN de sangre TANBead (Taiwan Advanced Nanotech Cª.). Luego, las muestras de ADN se genotiparon para el polimorfismo objetivo, ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) de cada gen candidato utilizando un servicio comercial establecido (Genomics BioSci & Tech. Co., Ltd, Taiwán). Los SNP designados se determinaron mediante discriminación alélica basada en PCR en tiempo real utilizando reactivos para ensayos de genotipado de SNP TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron sondas TaqMan para examinar ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) en el estudio actual. La amplificación por PCR y la discriminación alélica se realizaron utilizando un sistema de PCR en tiempo real ViiA7 (Applied Biosystems). El ajuste de la PCR cuantitativa se programó a 60 °C durante 30 s con una desnaturalización inicial de 10 min a 95 °C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante otros 15 s y hibridación a 60 °C durante 1 min. La detección de alelos y la discriminación alélica se realizaron durante 1 min a 60 °C. Luego, los datos sin procesar se analizaron utilizando el software ViiA7 (v1.2.4). La tasa de éxito del genotipado para el análisis del SNP objetivo (ALDH2 Glu487Lys [rs671, G/A]) fue >96,6 % con una tasa de desajuste del 0,0 %. Para el genotipado de ALDH2 en ratones, se extrajo ADN de ratón de muestras de cola de ratón utilizando un kit de genotipado de ratón KAPA (KAPA Biosystems). La punta de la cola de no más de 1–2 mm se digirió en un volumen de 100 μl que contenía 88 μl de agua de grado PCR, 2 μl de tampón de extracto KAPA Express 10X y 2 μl de enzima de extracto KAPA Express, a 75 °C durante 10 min, seguido de 95 ° C durante 5 min para inactivar la enzima. La PCR se realizó con 1 μl de ADN en 1 × KAPA2G Fast Genotyping Mix y cebadores 0,5 μM: 5 min desnaturalización a 95 °C, 35 ciclos (20 s a 95 °C, 20 s a 60 °C, 30 s a 72 °C ), y extensión final a 72 °C por 5 min. Los cebadores ALDH2 EG534 (GTTCTCTCCGATGACAGGATCAACTGCTAC) y EG536 (CAGACATTAACACACTGGGCATTTAGGTC). Los fragmentos de PCR amplificados por los cebadores EG534 se secuenciaron directamente utilizando EG535 (TACGTTCCCGTGGGCAGAACTGGTGCCTT)51.

Los datos humanos se analizaron utilizando el paquete de software STATA 14.0 (Stata Corp., College Station, Texas, EE. UU.). Los datos continuos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y se comparan mediante pruebas t de Student, a menos que se especifique lo contrario. Los valores categóricos, expresados ​​como números y porcentajes, se compararon utilizando la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, según correspondiera. La asociación del polimorfismo ALDH2 (como ALDH2 Vt) con los AV clínicos se evaluó mediante regresión logística. Además, probamos si la presencia de ALDH2 Vt modifica la asociación entre la ingesta de alcohol y la prolongación de AV o QTc. Los datos de los animales se sometieron a pruebas t de Student no pareadas o pruebas U de Mann-Whitney para comparar entre ratones con EtOH al 4 % y ratones con dieta normal dentro de la misma categoría de genotipo (Wt o ALDH2*2 KI), basados ​​en ECG, transferencia Western, inmunoconfocal, y datos electrofisiológicos ex vivo (abrazadera de ruta o mapeo óptico). Los análisis se realizaron con GraphPad Prism 8 (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.). El análisis estadístico fue de dos colas y la significancia se fijó en p < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las solicitudes para acceder al conjunto de datos de investigadores calificados capacitados en protocolos de confidencialidad de sujetos humanos pueden enviarse al Comité Institucional de Ética/Acceso a Datos del MacKay Memorial Hospital para investigadores (Información de contacto de la Junta de Revisión Institucional: MacKay Memorial Hospital. Dirección: No. 92, Sec. 2, Zhongshan N. Rd., Ciudad de Taipei 10449, Taiwán. TEL: 02-25433535#3486~3488, Correo electrónico: [email protected]). Las cifras subyacentes de los datos de origen se proporcionan en los Datos complementarios 1, y las versiones sin recortar de las transferencias se proporcionan en las Figuras complementarias. 11–15. Los datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

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El trabajo de C.-H. Chen y D. Mochly-Rosen El presente estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Salud de EE. UU. y se otorgó una subvención de investigación AA11147 a D. Mochly-Rosen. Este estudio fue apoyado además por el Consejo Nacional de Ciencias (NSC) (101-2314-B-195-020, 103-2314-B-010-005-MY3, 103-2314-B-195-001-MY3, 101- 2314-B-195-020–MY1), Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) (103-2314-B-195-006-MY3, 106-2314-B-195-008-MY2, 107-2320-B- 715-002-MY3, 108-2314-B-195-018-MY2, 109-2314-B-715-008, 110-2314-B-715-009-MY1, 110-2320-B-715-002, 111-2314-B-715-013, 111-2628-B-715-001-MY3), MacKay Memorial Hospital (10271, 10248, 10220, 10253, 10375, 10358, E-102003, MMH-108-127, MMH -110-114, MMH-110-03) y MacKay Medical College (MMC-RD-108-1B-33, MMC-RD-108-2B-02, MMC-RD-109-1B-18, MMC-RD- 110-CF-G001-02, MMC-RD-110-1E-P002, MMC-RD-111-1B-P025, MMC-RD-111-CF-G001-02).

Departamento de Medicina, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwán

An-Sheng Lee, Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Yun-Fang Chen, Wei-Yu Chen, Shih-Wei Wang, Chung-Lieh Hung y Hung-I Yeh

División de Medicina Cardiovascular, Hospital Universitario Médico de China, Taichung, Taiwán

an-sheng lee

Instituto de Ingeniería Biomédica, Facultad de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Hsinchu, Taiwán

Yen-Ling Sung y Shien-Fong Lin

Instituto de Graduados de Optomecatrónica Biomédica, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Yen-Ling Sung

Instituto de Graduados en Genómica Médica y Proteómica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, Taiwán

Szu-Hua Pan y Xuan-Ren Chen

Programa de Licenciatura en Biología de Sistemas y Genoma, Universidad Nacional de Taiwán y Academia Sinica, Taipei, Taiwán

Sartén Szu-Hua

Programa de Doctorado en Medicina Traslacional, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, Taiwán

Sartén Szu-Hua

División de Cardiología, Departamentos de Medicina Interna, MacKay Memorial Hospital, Taipei, Taiwán

Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Chung-Lieh Hung y Hung-I Yeh

Departamento de Investigación Médica, MacKay Memorial Hospital, New Taipei, Taiwán

Shiao-Li Ding, Ying-Jui Lu y Chin-Ling Hsieh

Departamento de Examen de Fisiología, MacKay Memorial Hospital, New Taipei, Taiwán

Chuan Chuan Liu

Centro de Ritmo Cardíaco y División de Cardiología, Departamento de Medicina, Hospital General de Veteranos de Taipei, Taipei, Taiwán

Fa Po Chung

Departamento de Medicina, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Facultad de Medicina, Taipei, Taiwán

Fa Po Chung

Instituto de Ciencias Biomédicas, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwán

Shih-Wei Wang y Chung-Lieh Hung

Departamento de Química y Biología de Sistemas, Universidad de Stanford, Facultad de Medicina, Stanford, CA, EE. UU.

Che-Hong Chen y Daria Mochly-Rosen

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Escritura: borrador original, ASL; administración de proyectos, ASL, YJL y CLH (Chin-Ling Hsieh); análisis formal, YLS y SHP; curación de datos, KTS y CHS; validación, SLD y WYC; software, YFC y SWW; supervisión, CCL y HIY; redacción: revisión y edición, XRC, FPC y CLH (Chung-Lieh Hung); adquisición de fondos, CHC, DMR y CLH (Chung-Lieh Hung); metodología, ASL, YLS y SHP; conceptualización, CLH (Chung-Lieh Hung) y HIY; recursos, HIY y SFL; abrazadera de parche, ASL; mapeo óptico, YLS; Imágenes inmunoconfocales, SHP Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia con Chung-Lieh Hung o Hung-I Yeh.

Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwán. Declaración de competencia de intereses: CH Chen y D. Mochly-Rosen poseen patentes relacionadas con la activación de ALDH2*1 y ALDH2*2 con ALDA-1. Una de las patentes tiene licencia para Foresee Pharmaceuticals, una empresa en la que D. Mochly-Rosen es consultor. Sin embargo, la empresa no contribuyó a ninguno de los experimentos incluidos en el estudio. Los otros autores contribuyentes afirmaron no tener conflictos de interés con respecto a la publicación de estos resultados.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Lee, AS., Sung, YL., Pan, SH. et al. Una variante común de aldehído deshidrogenasa 2*2 de Asia oriental promueve la arritmia ventricular con el consumo crónico de alcohol de ligero a moderado en ratones. Comun Biol 6, 610 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

Descargar cita

Recibido: 25 febrero 2022

Aceptado: 26 de mayo de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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